Mechanizm genotoksycznego działania i wybrane efekty epigenetyczne glifosatu, jego preparatu herbicydowego – Roundup 360 PLUS oraz metabolitu – kwasu aminometylofosfonowego w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej człowieka

Abstract

Stale rosnące zużycie pestycydów na świecie to bardzo ważny problem, dotyczący każdego z nas, ponieważ na każdy hektar kuli ziemskiej przypada aż 0,5 kg glifosatu. W aktualnym rejestrze środków ochrony roślin dopuszczonych do obrotu zezwoleniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi w Polsce, znajduje się aż 109 preparatów herbicydowych opartych o glifosat. Jednym z nich jest Roundup 360 PLUS, który zawiera glifosat w postaci soli potasowej oraz surfaktanty objęte tajemnicą producenta. Głównym produktem rozpadu glifosatu w roślinach, glebie i wodzie jest AMPA. Glifosat początkowo był uznawany za substancję bezpieczną dla ludzi. Natomiast w 2015 roku Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem – Agenda WHO – sklasyfikowała glifosat, jako związek prawdopodobnie kancerogenny dla ludzi (kategoria 2A). Pomimo udowodnionej (zdaniem IARC) rakotwórczości wobec zwierząt, związek ten uzyskał zgodę Komisji Europejskiej do stosowania w Unii do końca 2022 roku. Dotychczas nie określono mechanizmu genotoksycznego glifosatu, jego działania preparatu Roundup 360 PLUS i głównego metabolitu – AMPA, a także nie dokonano oceny ich wpływu na ludzki epigenom w zakresie stężeń odpowiadających potencjalnemu narażeniu środowiskowemu czy zawodowemu. Dlatego też biorąc pod uwagę fakt ciągłego wzrostu wykorzystania glifosatu w preparatach herbicydowych stosowanych w rolnictwie, niezbędne wydają się być dalsze badania, które dostarczą istotnych informacji w tym zakresie i być może przyczynią się do zmniejszenia ryzyka wystąpienia potencjalnych uszkodzeń DNA i rozwoju transformacji nowotworowej. Celem niniejszej pracy było określenie wpływu glifosatu, jego preparatu herbicydowego - Roundup 360 PLUS i metabolitu AMPA na jednojądrzaste komórki krwi obwodowej człowieka, a także porównanie genotoksyczności i wpływu tych ksenobiotyków na wybrane parametry epigenomu. PBMCs inkubowano przez 24 godziny z badanymi ksenobiotykami w różnym zakresie stężeń odpowiadających narażeniu środowiskowemu i zawodowemu. Analizie poddano jedno- i dwuniciowe pęknięcia DNA oraz dwuniciowe pęknięcia DNA, wykorzystując odpowiednio alkaliczną i neutralną wersję testu kometowego. Oceniono poziom oksydacyjnych uszkodzeń puryn i pirymidyn przy użyciu ludzkiej glikozylazy 8-oksoguaniny DNA i endonukleazy III. Dokonano analizy kinetyki naprawy powstałych uszkodzeń DNA przy użyciu alkalicznej wersji testu kometowego. Zweryfikowano zdolność tworzenia adduktów badanych związków i preparatu z DNA za pomocą testu relaksacji plazmidowego DNA (pUC19). Sprawdzono możliwość generowania reaktywnych formy tlenu, w tym rodnika hydroksylowego za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych dioctanu 6-karboksy-2’,7’-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH2DA) oraz 3’-(p hydroksyfenylo)fluoresceiny (HPF). Analizie poddano globalną metylację DNA poprzez kolorymetryczny pomiar 5-metylocytozyny w DNA oraz metylację regionów promotorowych genów supresorowych (P16, P21, TP53) i protoonkogenów (BCL2, CCND1) za pomocą metylospecyficznej reakcji PCR. Oceniono również profil ekspresji tych genów, a także genów związanych z procesami epigenetycznymi: genów zaangażowanych w proces metylacji DNA (DNMT1, DNMT3A), demetylacji DNA (TET2, TET3) oraz genów zaangażowanych w modyfikację białek histonowych (EHMT1, EHMT2, HDAC3, HDAC5) za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Część pracy dotycząca oceny uszkodzeń DNA została wykonana we współpracy z prof. dr hab. Katarzyną Woźniak, kierownikiem Katedry Genetyki Molekularnej UŁ. Doświadczenia z zakresu epigenetyki zostały wykonywane w ramach stażu w Instytucie Medycyny Pracy im. Prof. Nofera w Łodzi i współpracy z dr hab. Edytą Reszką, prof. nadzw. IMP, kierownikiem Zakładu Genetyki Molekularnej i Epigenetyki IMP. Uzyskane wyniki wskazują, że badane związki i preparat pestycydowy indukują powstawanie zarówno jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA, jak i uszkodzeń oksydacyjnych w postaci utleniania puryn i pirymidyn. Zarówno glifosat, AMPA jak i Roundup 360 PLUS nie są zdolne do tworzenia adduktów z DNA, podczas gdy zwiększają one generowanie reaktywnych form tlenu, w tym rodnika hydroksylowego w PBMCs. Roundup 360 PLUS w porównaniu do glifosatu i AMPA wykazuje najbardziej genotoksyczne działanie (już w stężeniu 5 μM powoduje szereg uszkodzeń DNA). Działanie preparatu herbicydowego w przeciwieństwie do glifosatu i AMPA uniemożliwia pełną naprawę powstałych uszkodzeń DNA. Obserwowane zmiany nie wiązały się z bezpośrednią interakcją badanych ksenobiotyków z DNA (nie zaobserwowano powstawania adduktów), ale najprawdopodobniej wystąpiły jako pośrednie działanie tych substancji na DNA poprzez indukcję RFT. Uzyskane wyniki wskazują na istotne statystycznie obniżenie globalnej metylacji DNA w wyniku ekspozycji PBMCs na badane ksenobiotyki. Roundup 360 PLUS, glifosat i AMPA zmieniają metylację regionów promotorowych genów supresorowych P21 i TP53 oraz w przypadku Roundup’u 360 PLUS również protoonkogenu BCL2. Badane związki i preparat herbicydowy zmieniają profil ekspresji genów zaangażowanych w kluczowe procesy epigenetyczne (CCND1, DNMT1, TET2, HDAC3; P16 i TP53 – w przypadku glifosatu i Roundup’u 360 PLUS oraz P21 i BCL2 w przypadku samego glifosatu), czego następstwem jest zaburzenie wyżej wymienionych mechanizmów molekularnych. Zmiany w epigenomie mogą skutkować modyfikacją struktury chromatyny i zaburzeniem cyklu komórkowego, w efekcie prowadząc do rozwoju transformacji nowotworowej.