Rola stresu oksydacyjnego i nitracyjnego oraz stanu zapalnego w molekularnym mechanizmie rozwoju kamicy moczowej i raka pęcherza moczowego, DEC-2022/06/X/NZ5/00331, MINIATURA 6 (dataset)

Abstract

Wśród chorób układu moczowego najczęściej diagnozowane są kamica moczowa i rak pęcherza moczowego (BC, ang. bladder cancer), które cechują się wysokim ryzykiem nawrotu i znaczącymi kosztami leczenia, co uzasadnia potrzebę ciągłego pogłębiania badań nad molekularnymi podstawami rozwoju tych chorób. Szczególne znaczenie może mieć zwrócenie uwagi na wspólny patomechanizm tych schorzeń, gdyż raporty epidemiologiczne wskazują na występowanie wielu podobieństw, a wśród nich, obok wysokiego odsetka nawrotu, na uwagę zasługują wspólne dla kamicy moczowej i BC czynniki ryzyka, takie jak płeć męska czy palenie tytoniu. Jednak, pomimo licznych badań nad czynnikami rozwoju tych chorób, które wskazują na kluczową rolę powiązanych ze sobą szlaków biochemicznych, takich jak stres oksydacyjny i nitracyjny oraz stan zapalny, wspólne podłoże molekularne obu schorzeń nadal pozostaje niewyjaśnione. Kamica moczowa jest chorobą przewlekłą, związaną z pojawieniem się w drogach moczowych złogów, które blokują przepływ moczu. Złogi te formułują się w konsekwencji wzrostu stężenia i krystalizacji nierozpuszczalnych składników moczu, w tym szczawianu wapania. W wyniku krystalizacji, szczawian wapnia może ulegać adhezji na powierzchni komórek kanalików nerkowych, a następnie może być internalizowany do komórek na drodze makropinocytozy w celu eliminacji. Produktami końcowymi degradacji szczawianów wapnia są wolne jony szczawianu i Ca2+, które zwiększają pulę wewnątrzkomórkowego wapnia. Przeładowanie komórek wapniem może prowadzić do dysfunkcji mitochondriów i nadprodukcji reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), a w konsekwencji także indukować rozwój stanu zapalnego. Dotychczasowe wyniki wykazały, że pacjenci z kamicą moczową cechują się zwiększonym poziomem markerów peroksydacji lipidów (8-izoprostaglandyny F2 oraz malonylodialdehydu), a także cytokin prozapalnych (interleukiny 8) w moczu, surowicy i osoczu. Nadmiar ROS może również powodować uszkodzenia zarówno mtDNA jak i nDNA. W związku z tym, długotrwała nadprodukcja ROS i utrzymujący się stan zapalny obserwowane zwłaszcza u osób z nawracającymi atakami kolki nerkowej mogą przyczynić się do procesu kancerogenezy i rozwoju BC, który jest drugim najczęstszym nowotworem układu moczowo-płciowego. Podobnie jak w przypadku kamicy moczowej, także w przebiegu BC obserwuje się nasilenie procesów stresu oksydacyjnego i nitracyjnego. Badania przewidziane do realizacji w ramach planowanego projektu mają na celu zidentyfikowanie molekularnych podstaw istniejących zaburzeń w szlakach biochemicznych, które manifestują się stresem oksydacyjnym i nitracyjnym oraz stanem zapalnym w rozwoju kamicy moczowej i BC. W tym celu proponowane badania mają określić związek występowania wariantów polimorficznych (SNPs, ang. single nucleotide polymorphisms) genów SOD2 i NOS2 oraz IL-6 i IL-8, jak również poziomu ekspresji mRNA dla tych genów z rozwojem kamicy i BC. Wykazanie takiego związku pozwoli na wstępne wytypowanie potencjalnych biomarkerów prognostycznych, określających ryzyko rozwoju obu schorzeń. Planowane eksperymenty będą prowadzone we współpracy z Oddziałem Urologii Wojewódzkiego Szpitala Zespolonego im. M. Kacprzaka w Płocku. W ramach planowanego projektu zakłada się kwalifikację: 100 pacjentów ze zdiagnozowanym BC (w wieku 35-75 lat), 100 z kamicą moczową (w wieku 35-75 lat) hospitalizowanych na Oddziale Urologii WSZ w Płocku oraz homologicznej grupy 100 zdrowych ochotników na podstawie zgody Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Łódzkiego nr 12/KBBN-UŁ/II/2020-21. Podczas procesu rekrutacji wśród uczestników przeprowadzona zostanie ankieta dotyczącą m.in.: wieku, płci, BMI, palenia tytoniu. Podstawowy materiał badawczy do realizacji zaplanowanych zadań stanowić będzie krew pełna pobrana z żyły łokciowej od każdego uczestnika badania Analiza SNPs będzie przeprowadzona na wyizolowanym z krwi pełnej DNA przy użyciu sond TaqMan™ SNP Genotyping Assay. Natomiast analiza ekspresji mRNA będzie przeprowadzona na wyizolowanym z krwi obwodowej RNA z zastosowaniem sond TaqMan™ Gene Expression Assay. Analiza wariantów polimorficznych przyczyni się do weryfikacji hipotezy zakładającej wspólny mechanizm rozwoju kamicy moczowej i BC. A określenie wpływu badanych polimorfizmów na poziom ekspresji genów może stanowić punkt wyjścia do opracowania markerów wczesnej identyfikacji pacjentów z grupy ryzyka rozwoju kamicy moczowej, a w konsekwencji również BC. Oczekuje się, że wyniki uzyskane w ramach proponowanego działania naukowego pozwolą na weryfikację hipotezy, zakładającej wspólny mechanizm rozwoju kamicy moczowej i BC, oparty na zaburzeniach funkcji synonimicznych czynników, zaangażowanych w stres oksydacyjny i nitracyjny oraz stan zapalny. Co więcej, badanie to umożliwi dokładniejsze zrozumienie patofizjologii kamicy moczowej i BC na poziomie molekularnym. W konsekwencji zdobyta wiedza będzie stanowiła podstawę do przeprowadzenia dalszych szeroko zakrojonych badań.

Among the diseases of the urinary system, urolithiasis and bladder cancer (BC) are most often diagnosed, which are characterized by a high risk of recurrence and significant treatment costs, which justifies the need for continuous research into the molecular basis of the development of these diseases. It may be of particular importance to pay attention to the common pathomechanism of these diseases, as epidemiological reports indicate the occurrence of many similarities, and among them, apart from the high rate of recurrence, risk factors common for urolithiasis and BC, such as male sex or smoking, deserve attention. However, despite numerous studies on the factors of development of these diseases, which indicate the key role of interrelated biochemical pathways, such as oxidative and nitrative stress and inflammation, the common molecular basis of both diseases still remains unexplained. Urolithiasis is a chronic disease associated with the appearance of deposits in the urinary tract that blocks the flow of urine. These deposits are formed as a consequence of the increase in the concentration and crystallization of insoluble urine components, including calcium oxalate. As a result of crystallization, calcium oxalate can adhere to the surface of renal tubular cells and can then be internalized into the cells by macropinocytosis for elimination. The end products of calcium oxalate degradation are free oxalate and Ca2+ ions, which increase the pool of intracellular calcium. Overloading cells with calcium can lead to mitochondrial dysfunction and overproduction of reactive oxygen species (ROS), and consequently, also induce the development of inflammation. The results obtained so far have shown that patients with urolithiasis are characterized by increased levels of markers of lipid peroxidation (8-isoprostaglandin F2 and malondialdehyde), as well as pro-inflammatory cytokines (interleukins 8) in urine, serum and plasma. Excess ROS can also cause damage to both mtDNA and nDNA. Therefore, long-term overproduction of ROS and persistent inflammation observed especially in people with recurrent attacks of renal colic may contribute to the process of carcinogenesis and development of BC, which is the second most common cancer of the genitourinary system. As in the case of urolithiasis, intensification of oxidative and nitrative stress processes is also observed in the course of BC. The research to be carried out as part of the planned project is aimed at identifying the molecular basis of existing disorders in biochemical pathways, which are manifested by oxidative and nitration stress and inflammation in the development of urolithiasis and BC. To this end, the proposed studies are to determine the relationship between the occurrence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the SOD2 and NOS2 and IL-6 and IL-8 genes, as well as the level of mRNA expression for these genes with the development of urolithiasis and BC. Demonstrating such a relationship will allow for the initial selection of potentially predictive biomarkers determining the risk of developing both diseases. The planned experiments will be conducted in cooperation with the Department of Urology of the Provincial Hospital of M. Kacprzak in Płock. The planned project assumes the qualification of 100 patients diagnosed with BC (aged 35-75), 100 with urolithiasis (aged 35-75) hospitalized at the Department of Urology of the WSZ in Płock and a homologous group of 100 healthy volunteers based on consent Bioethics Committee of the University of Lodz No. 12/KBBN-UŁ/II/2020-21. During the recruitment process, a survey will be conducted among the participants regarding, among others: age, gender, BMI, and smoking. The basic research material for the implementation of the planned tasks will be whole blood collected from the cubital vein from each participant of the study. SNPs analysis will be carried out on DNA isolated from whole blood using TaqMan™ SNP Genotyping Assay probes. The analysis of mRNA expression will be carried out on RNA isolated from peripheral blood using TaqMan™ Gene Expression Assay probes. The analysis of polymorphic variants will contribute to the verification of the hypothesis assuming a common mechanism for the development of urolithiasis and BC. Determining the impact of the studied polymorphisms on the level of gene expression may be a starting point for the development of markers for the early identification of patients at risk of developing urolithiasis, and consequently also BC. It is expected that the results obtained as part of the proposed scientific activity will allow us to verify the hypothesis assuming a common mechanism of urolithiasis and BC, based on dysfunctions of synonymous factors involved in oxidative and nitrative stress and inflammation. Moreover, this study will provide a better understanding of the pathophysiology of urolithiasis and BC at the molecular level. As a consequence, the acquired knowledge will form the basis for further extensive studies.