Mechanizm indukowanej kinetyną śmierci komórek korzeni Vicia faba ssp. minor

Abstract

Programowana śmierć komórkowa (PCD) jest jednym z kluczowych procesów będących podstawą prawidłowego wzrostu, rozwoju oraz funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych. Jest także integralnym elementem obronnych reakcji organizmów na biotyczne i abiotyczne czynniki zewnętrzne. W przypadku komórek zwierząt lub człowieka egzogenne induktory śmierci komórkowej stosowane są np. w celu ograniczenia wzrostu guzów nowotworowych. W kontekście komórek roślinnych śmierć komórkowa indukowana czynnikami zewnętrznymi może stanowić element przystosowania się ich do zmieniających się warunków środowiskowych np. poprzez indukcję powstawania aerenchymy. W komórkach roślinnych śmierć komórkową indukować można naturalnymi cytokininami np. BAP lub kinetyną. Śmierć komórkowa, niezależnie od tego czy występuje naturalnie czy została indukowana czynnikami zewnętrznymi, jest procesem wieloetapowym, obejmującym fazę recepcji sygnału śmierci, fazę wykonawczą (fazę transdukcji sygnału) oraz fazę degradacji elementów metabolizmu i struktury komórki. Zdolność kinetyny do indukcji śmierci oraz założenie, że proces tej śmierci jest wieloetapowy, stały się podstawą badań przeprowadzanych w niniejszej rozprawie doktorskiej. Nadrzędnym celem niniejszej pracy było ustalenie szlaku recepcji i przekazywania sygnału śmierci komórek kory pierwotnej korzeni siewek V. faba ssp. minor z udziałem kinetyny z uwzględnieniem metabolizmu i przebiegu degradacji wybranych elementów komórki będących elementem mechanizmu indukcji tego procesu. Układ badawczy stanowiły 3-dniowe siewki V. faba ssp. minor poddane działaniu kinetyny w stężeniu 46 µM oraz kinetyny wraz z wybranymi czynnikami posiadającymi wpływ na wybrane elementy związane z kolejnymi fazami procesu śmierci. Badania prowadzone były z wykorzystaniem 2-cm apikalnych fragmentów korzeni siwek bobiku ze szczególnym uwzględnieniem komórek kory pierwotnej tych korzeni. Przeprowadzone analizy objęły identyfikację procesu śmierci komórkowej indukowanej kinetyną w zaplanowanych układach badwczych, analizy udziału receptorów cytokininowych i czynników szlaku regulacji metabolizmu cytokinin w kontroli tego procesu. Następnie analizowano udział specyficznych molekuł uczestniczących w procesie śmierci zarówno na etapie transdukcji sygnałów jak i na etapie degradacji składników komórkowych. Na koniec podjęto się charakterystyki morfologicznych i metabolicznych przejawów degradacji jąder komórkowych oraz degradacji chromatyny. Zasadniczą metodykę badań stanowiły obserwacje mikroskopowe prowadzone z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Obserwacje mikroskopowe skupione były na komórkach kory pierwotnej 2-cm apikalnych fragmentów korzeni siwek bobiku (z pominięciem komórek strefy merystematycznej). Ponadto wykonano szereg analiz biochemicznych, a w tym spektrofotometrycznych oraz spektrofluorymetrycznych, prowadzonych w oparciu o całe 2-cm apikalne fragmenty korzeni siewek bobiku. Wyniki badań uzyskane w niniejszej rozprawie potwierdziły, że proces śmierci komórkowej indukowany kinetyną ma charakter wieloetapowy. Rozpoczyna się on od recepcji sygnału cytokininowego odbieranego przez specyficzne receptory cytokininowe. W kolejne etapy transdukcji sygnału zaangażowane są metabolity kinetyny (najprawdopodobniej fosforany). Jednym z pośredników sygnałów śmierci są jony wapnia, które mogą kontrolować proces śmierci na różnych jego etapach w systemie tzw. sprzężenia zwrotnego. Transdukcja sygnału śmierci indukowanego kinetyną może również odbywać się z udziałem cytochromu c, proteaz serynowych i proteasomów. Jednym z charakterystycznych przejawów śmierci komórkowej indukowanej kinetyną jest proces kondensacji frakcji chromatyny bogatej w pary AT. Ponadto ostateczna degradacja DNA, będąca końcowym przejawem śmierci komórkowej, zależy od aktywności enzymów nukleolitycznych, których aktywacja może zależeć zarówno od serynowych jak i cysteinowych proteaz, a także nukleaz zasadowych. Z procesem śmierci komórkowej indukowanej kinetyną związane jest tworzenie się mikrojąder, jednak geneza ich powstawania podczas tego procesu nie została w pełni wyjaśniona. Sugerować można jedynie, że mikrojądra mogą pełnić funkcję w utrzymaniu prawidłowej zawartości DNA w jądrach komórkowych komórek, które przeszły proces amplifikacji lub mogą być sygnałem kierującym komórkę na drogę śmierci. Wydaje się również, że struktury nazwane mikrojądrami mogą być także ciałami pseudoapoptotycznymi, specyficznym dla roślin odpowiednikiem zwierzęcych ciał apoptotycznych. Na podstawie wyników ustalono, że kluczowymi godzinami w przebiegu śmierci komórkowej indukowanej kinetyną są 1, 3, 12, 18, 24 i 72 h. Ponadto zaproponowano schemat przebiegu procesu śmierci komórkowej indukowanej kinetyną oraz schemat mechanizmu jego regulacji.

The programmed cell death (PCD) plays a crucial role in various processes ensuring the proper growth and development of both plants and animals. Moreover, PCD functions as an integral part of the defense against biotic and abiotic factors.There are various applications of induced cell death. Different exogenous factors like chemotherapy are used to trigger apoptosis in many types of human or animal cancer. Externally induced cell death in plants may be used for modifying the plants in order to adapt them to changing environmental conditions (eg. induction of aerenchyma formation). Cytokinins such as benzylaminopurine (BAP) and kinetin are potent inducers of cell death process in plants. Both types of cell death (physiological and externally induced) are mediated by specific multi-step signaling pathway that includes death signal reception, signal transduction, and degradation phase. The ability of kinetin to induce plant cell death and the assumption that this process is multi-stage became the starting point for this doctoral thesis. The overall objective of this research was to determine the specific multi-step signal transduction mechanism and to track the hydrolysis of cellular macromolecules, such as proteins and nucleic acids during the kinetin-induced cell death in cortex cells of V. faba ssp minor seedlings roots. First, three-days-old seedlings of V. faba ssp minor were incubated in a mixture of 46 µM kinetin and selected factors that display inhibitory effect on successive phases of the cell death process. Subsequently, 2-cm long roots of the seedlings were used for experiments. The obtained results are mainly based on the fluorescence microscopy observations which were focused on cortex cells of V. faba ssp minor seedlings roots. In addition, series of biochemical spectrophotometrical and spectrofluorometrical analyses were conducted. The obtained results indicate that the kinetin-induced cell death is a multi-stage process which starts with the cytokinin signal received by specific receptors. The subsequent signal transduction steps are mediated by the metabolites of kinetin, most likely phosphates. It is highly possible that calcium ions are the signaling molecules that can control the cell death process at different stages in the feedback system. Moreover, cytochrome c, serine proteases and proteasomes may also be engaged in kinetin-induced cell death signal transduction. Morphological changes in the chromatin including the condensation of AT rich fragments into heterochromatin fraction in root cortex cells were one of the characteristic symptoms of kinetin-induced cell death. Furthermore, the final degradation of DNA, which is the ultimate manifestation of cell death, depends on the activity of nucleolytic enzymes. The activation of these enzymes may be triggered by both the serine and cysteine proteases, as well as alkaline nucleases. Moreover, kinetin-induced cell death in roots cortex cells of V. faba ssp minor seedlings is associated with the formation of micronuclei. The genesis of their formation still remains unclear. However, the obtained results and the scientific literature suggest that micronuclei can form after the process of amplification. Formed micronuclei are possibly capable of reestablishing the viability of the cells, since their nuclear content would be equilibrated. Regardless of whether the micronuclei are composed of chromosomal losses or chromosomal fragments, they can trigger the cell death process. Furthermore, it seems that the micronuclei structure, so-called pseudoapoptic bodies, might be a plant equivalent of apoptotic bodies observed in animal cells. Based on the results, it has been establish that the 1, 3, 12, 18, 24, and 72 h are the key time points in the kinetin-induced cell death process. Moreover, a model of the induction and regulation of PCD process in the roots cortex cells of V. faba ssp minor seedlings was proposed.