http://hdl.handle.net/11089/1 Tue, 15 Sep 2026 17:15:20 GMT 2026-09-15T17:15:20Z https://dspace.uni.lodz.pl:443/xmlui/bitstream/id/4322885a-3abf-4f62-88fd-762733949669/ http://hdl.handle.net/11089/1 http://hdl.handle.net/11089/59289 Udział olejku eterycznego z Thymus vulgaris L. w łagodzeniu stresu wywołanego kadmem w komórkach merystemów korzeniowych Vicia faba L. var. minor Gocek-Szczurtek, Natalia Wobec narastającego skażenia środowiska kadmem (Cd) celem badań była ocena 24-godzinnego wpływu 175 μM CdCl₂ na funkcjonowanie merystemów korzeni zarodkowych Vicia faba L. var. minor oraz określenie ochronnego działania olejku tymiankowego (TO; 0,03%). Ekspozycja na Cd prowadziła do jego znacznej akumulacji w tkankach, nadprodukcji reaktywnych form tlenu (RFT), nasilenia peroksydacji lipidów i uszkodzeń DNA, mimo aktywacji enzymatycznych i nieenzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych oraz metabolizmu tiolowego. Towarzyszyły temu zmiany ultrastrukturalne organelli, aktywacja szlaku MAPK oraz przeprogramowanie epigenetyczne obejmujące wzrost metylacji DNA i zmiany modyfikacji histonów, a także zaburzenia replikacji i transkrypcji. Spadek zawartości CDKA i CycB, nieprawidłowa fosforylacja histonu H3 oraz dezorganizacja mikrotubul i filamentów aktynowych prowadziły do zahamowania proliferacji komórek merystematycznych i wzrostu korzeni. TO stosowany samodzielnie nie destabilizował struktury ani funkcji komórek, a w warunkach ekspozycji na Cd częściowo ograniczał jego akumulację i łagodził skutki toksyczności. Przy jednoczesnym zastosowaniu Cd i TO obserwowano ograniczenie akumulacji RFT, wzmocnienie mechanizmów antyoksydacyjnych oraz mniejsze nasilenie peroksydacji lipidów i uszkodzeń DNA. TO sprzyjał zachowaniu integralności ultrastrukturalnej komórek oraz ograniczał indukowane przez Cd zaburzenia szlaku MAPK i zmiany epigenetyczne, utrzymując transkrypcję i replikację bliżej poziomu kontrolnego. Przeciwdziałał także dezorganizacji cytoszkieletu i aparatu mitotycznego, sprzyjając zachowaniu proliferacji komórek merystematycznych i wzrostu korzeni. Opracowanie i adaptacja metody iPOND do materiału roślinnego rozszerzyły możliwości przyszłej analizy białek związanych z nowo syntetyzowanym DNA. Wyniki wskazują, że TO działa wielokierunkowo i może stanowić naturalny czynnik wspierający ochronę roślin przed stresem kadmowym.; In the context of increasing environmental cadmium (Cd) contamination, this study aimed to evaluate the effects of 24 h exposure to 175 μM CdCl₂ on root meristems of Vicia faba L. var. minor and to assess the protective effects of thyme essential oil (TO; 0.03%). Cd exposure caused substantial metal accumulation, reactive oxygen species (ROS) overproduction, increased lipid peroxidation, and DNA damage, despite activation of antioxidant mechanisms and thiol metabolism. These effects were accompanied by organelle ultrastructural alterations, MAPK activation, epigenetic reprogramming involving increased DNA methylation and altered histone modifications, and disturbances in replication and transcription. Reduced CDKA and CycB levels, abnormal histone H3 phosphorylation, and disorganization of microtubules and actin filaments contributed to inhibited meristematic cell proliferation and root growth. TO alone did not destabilize cellular structure or function, while in the presence of Cd it partially limited metal accumulation and alleviated its toxic effects. During simultaneous exposure to Cd and TO, reduced ROS accumulation, enhanced antioxidant responses, and lower lipid peroxidation and DNA damage were observed. TO also promoted preservation of cellular ultrastructure and attenuated Cd-induced disturbances in MAPK signaling and epigenetic regulation, maintaining transcription and replication closer to control levels. It additionally counteracted disorganization of the cytoskeleton and mitotic apparatus, thereby supporting meristematic cell proliferation and root growth. Adaptation of the iPOND method to plant material expanded opportunities for future analysis of proteins associated with newly synthesized DNA. Overall, TO exerted multifaceted protective effects and may support plant protection against cadmium stress. Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/11089/59289 2026-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/59161 Identyfikacja niskocząsteczkowych związków hamujących aktywność wybranych enzymów zaangażowanych w metabolizm RNA u Helicobacter pylori Skibiński, Jakub Mikołaj The increasing antibiotic resistance of Helicobacter pylori (H. pylori) significantly reduces the effectiveness of eradication therapies and highlights the urgent need to identify novel molecular targets for potential therapeutic substances. This study aimed to characterize selected components of the H. pylori RNA degradosome - polynucleotide phosphorylase (PNPase), the RNA helicase RhpA, and the protein PapS with particular emphasis on evaluating PNPase as a potential therapeutic target. Additionally, the function of PapS in RNA metabolism and its interaction with RhpA were investigated. Recombinant PNPase, RhpA, and PapS were successfully purified. Enzymatic assays for PNPase activity, including RNA polymerization and degradation reactions, were optimized to enable downstream inhibitor screening. The spatial structure of PNPase was resolved, followed by structural-functional analyses and interaction studies of the RhpA-PapS complex. PNPase was shown to form a homotrimeric assembly and to retain enzymatic activity under conditions compatible with high-throughput screening applications. PapS did not exhibit polyadenylation activity toward single-stranded RNA; however, it catalyzed the sequential addition of the 3′-terminal CCA sequence to tRNA, consistent with its role as a CCA-adding enzyme. A transient and moderate interaction between PapS and RhpA was detected. Transcriptomic analysis revealed limited changes in gene expression in the H. pylori G27 Δpnp and ΔpapS strains, whereas deletion of rhpA resulted in extensive transcriptomic remodeling. Although pnp deletion did not abolish bacterial viability, it markedly impaired adaptive capacity. The Δpnp strain displayed reduced tolerance to temperature stress (slower growth at 39°C and decreased survival at 4°C), increased sensitivity to UV-C radiation and oxidative stress, reduced motility and urease as well as catalase activity, while enhanced ability to biofilm complex formation, which needs further study to elucidate the potential mechanism. A four-stage screening strategy for PNPase inhibitors was implemented, integrating in vitro enzymatic assays, qualitative selection steps, and evaluation using bacterial cells. From a library of 8,562 compounds, 23 candidates were selected for further validation. Among them, niclosamide exhibited the most pronounced PNP-dependent activity profile. Collectively, these findings indicate that although H. pylori PNPase is not essential for viability, it represents a central regulatory node in RNA metabolism that governs stress response and adaptive phenotypes. Therefore, PNPase constitutes a rational and promising target for the development of novel antibacterial strategies.; Narastająca lekooporność Helicobacter pylori (H. pylori) na stosowane obecnie antybiotyki ogranicza skuteczność eradykacji, co wiąże się z koniecznością poszukiwania nowych celów molekularnych dla potencjalnych leków. W pracy scharakteryzowano wybrane komponenty degradosomu RNA H. pylori, biorąc pod uwagę ich strukturę i funkcję, a także wzajemne oddziaływania: fosforylazę polinukleotydową PNP (PNPazę), helikazę RhpA oraz białko PapS, ze szczególnym uwzględnieniem roli PNP jako potencjalnego celu terapeutycznego. Określono funkcję PapS w metabolizmie RNA i zbadano występowanie interakcji PapS-RhpA. Oczyszczono rekombinowane białka PNP, RhpA i PapS. Zoptymalizowano testy aktywności PNP (reakcje polimeryzacji i degradacji RNA). Wykazano, że PNPaza występuje w formie trimeru i zachowuje aktywność enzymatyczną w warunkach umożliwiających dalsze badania przesiewowe. PapS nie wykazywało aktywności poliadenylacyjnej wobec jednoniciowego RNA, natomiast katalizowało sekwencyjną dobudowę końca 3′ CCA do tRNA, co wskazuje na funkcję enzymu dobudowującego CCA. Stwierdzono przejściowe, umiarkowane oddziaływanie PapS-RhpA. Analiza transkryptomiczna ujawniła ograniczone zmiany ekspresji w szczepach delecyjnych H. pylori G27 Δpnp i ΔpapS oraz rozległą przebudowę profilu transkryptomicznego w ΔrhpA. Delecja pnp nie wiązała się z obumieraniem komórek, lecz powodowała istotne ograniczenie zdolności adaptacyjnych: obniżenie tolerancji na stres temperaturowy (wolniejszy wzrost w 39°C i słabsze przeżycie w 4°C), wzrost wrażliwości na UV-C i stres oksydacyjny, zahamowanie ruchliwości i aktywności ureazy oraz katalazy. Jakkolwiek delecja pnp wiązała się z nasileniem tworzenia obszaru biofilmu, czego wyjaśnienie wymaga dalszych badań. Zastosowano czteroetapową strategię przesiewową użytych w badaniach inhibitorów PNP łączącą testy in vitro, selekcję jakościową i ocenę działania wobec komórek bakteryjnych. Z biblioteki 8562 związków wyłoniono 23 kandydatów do dalszej weryfikacji, a najbardziej obiecujący profil działania zależny od obecności PNP wykazał niklozamid. Uzyskane wyniki wskazują, że PNPaza H. pylori, mimo że nie jest niezbędna do przeżycia bakterii stanowi kluczowy węzeł regulacji metabolizmu RNA determinujący odpowiedź stresową i fenotypy adaptacyjne bakterii oraz racjonalny cel dla poszukiwania inhibitorów PNP w celach terapeutycznych. Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/11089/59161 2026-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/58796 Yeast display for directed evolution of amadoriase, an enzyme capable of cleaving protein glycation products - MINIATURA 8 (2024/08/X/NZ1/01781) (dataset) Studzian, Maciej This dataset was generated as part of the Miniatura 8 project, which focused on amadoriases. These FAD-dependent enzymes catalyze the breakdown of glycated amino acids, producing a free amino acid, glucosone, and hydrogen peroxide. Naturally occurring in fungi and bacteria, they are of considerable practical importance due to their applications in medical diagnostics and their potential therapeutic use, particularly in the treatment of diseases such as diabetes. Previous attempts to improve amadoriase I from Aspergillus through targeted amino acid substitutions increased the enzyme's thermostability but did not enhance its catalytic activity. Similarly, directed evolution of the related enzyme amadoriase II resulted in only marginal improvements. The aim of this project was to develop methods for the in vitro evolution of amadoriases to increase their activity using a non-directed, ultra-high-throughput approach based on yeast surface display. This technique enables the generation of random enzyme variants displayed on the surface of yeast cells, which can then be screened for catalytic activity. A biotin- and azide-modified fructoselysine analogue, designed to mimic a glycated substrate, was successfully synthesized and immobilized on the yeast surface to serve as a substrate for activity screening. Upon catalysis by an amadoriase, the substrate was expected to lose its fluorescence, allowing fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate yeast cells displaying enzyme variants with higher catalytic activity. A previously engineered variant of amadoriase II from Aspergillus fumigatus (AmaII_SII_82) was used as the starting point for the evolution experiments. Unfortunately, because the initial enzyme exhibited only negligible activity toward the biotin-modified substrate, the variants obtained after three rounds of sorting also failed to show the expected improvement in activity. Nevertheless, the techniques developed during this research provide a strong foundation for future studies aimed at improving other classes of deglycating enzymes, such as FN3K and FrlB/FrlD. Mon, 01 Jun 2026 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/11089/58796 2026-06-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/58757 Ochronna rola CORMs w łagodzeniu stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego indukowanego doksorubicyną w modelu prawidłowych komórek skóry - MINIATURA 8 2024/08/X/NZ7/01320 (dataset) Juszczak, Michał Doxorubicin is a potent anticancer drug that unfortunately damages healthy cells. Researchers from the University of Łódź investigated whether carbon monoxide could protect against these side effects. They used CORMs (carbon monoxide-releasing molecules)—specifically CORM-2 and CORM-3—which safely deliver the gas to cells. The team tested these on healthy human fibroblasts exposed to doxorubicin, alongside inactive, gas-free molecules as a control. While pretreating cells with CORMs did not prevent the drug's overall toxicity, it effectively combated oxidative stress. Both CORM-2 and CORM-3 significantly reduced destructive oxygen free radicals induced by doxorubicin. Surprisingly, the inactive, gas-free molecules were equally effective at this. The researchers also assessed programmed cell death by measuring caspase activity. Active CORM-3 inhibited this process, showing a protective effect, whereas CORM-2 unexpectedly accelerated cell death. Additionally, CORM-3 reduced the activity of certain oxidative stress response genes without affecting inflammatory genes or final defensive protein levels. This research highlights the complex relationship between carbon monoxide releasers and chemotherapy. Although these molecules are not a cure-all for doxorubicin's toxicity, they possess valuable antioxidant properties. Crucially, the study reveals that the positive intracellular effects often stemmed from the molecule’s structural backbone itself rather than the released carbon monoxide. This discovery is a significant step toward understanding cellular mechanisms and designing better protective therapies for cancer patients. Dane dotyczą wyników z oznaczeń: cytotoksyczności, reaktywnych form tlenu, apoptozy, ekspresji genów i białek zaangażowanych w stan zapalny i stres oksydacyjny. Tue, 10 Dec 2024 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/11089/58757 2024-12-10T00:00:00Z