http://hdl.handle.net/11089/1309 2026-09-14T14:02:50Z http://hdl.handle.net/11089/59289 Udział olejku eterycznego z Thymus vulgaris L. w łagodzeniu stresu wywołanego kadmem w komórkach merystemów korzeniowych Vicia faba L. var. minor Gocek-Szczurtek, Natalia Wobec narastającego skażenia środowiska kadmem (Cd) celem badań była ocena 24-godzinnego wpływu 175 μM CdCl₂ na funkcjonowanie merystemów korzeni zarodkowych Vicia faba L. var. minor oraz określenie ochronnego działania olejku tymiankowego (TO; 0,03%). Ekspozycja na Cd prowadziła do jego znacznej akumulacji w tkankach, nadprodukcji reaktywnych form tlenu (RFT), nasilenia peroksydacji lipidów i uszkodzeń DNA, mimo aktywacji enzymatycznych i nieenzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych oraz metabolizmu tiolowego. Towarzyszyły temu zmiany ultrastrukturalne organelli, aktywacja szlaku MAPK oraz przeprogramowanie epigenetyczne obejmujące wzrost metylacji DNA i zmiany modyfikacji histonów, a także zaburzenia replikacji i transkrypcji. Spadek zawartości CDKA i CycB, nieprawidłowa fosforylacja histonu H3 oraz dezorganizacja mikrotubul i filamentów aktynowych prowadziły do zahamowania proliferacji komórek merystematycznych i wzrostu korzeni. TO stosowany samodzielnie nie destabilizował struktury ani funkcji komórek, a w warunkach ekspozycji na Cd częściowo ograniczał jego akumulację i łagodził skutki toksyczności. Przy jednoczesnym zastosowaniu Cd i TO obserwowano ograniczenie akumulacji RFT, wzmocnienie mechanizmów antyoksydacyjnych oraz mniejsze nasilenie peroksydacji lipidów i uszkodzeń DNA. TO sprzyjał zachowaniu integralności ultrastrukturalnej komórek oraz ograniczał indukowane przez Cd zaburzenia szlaku MAPK i zmiany epigenetyczne, utrzymując transkrypcję i replikację bliżej poziomu kontrolnego. Przeciwdziałał także dezorganizacji cytoszkieletu i aparatu mitotycznego, sprzyjając zachowaniu proliferacji komórek merystematycznych i wzrostu korzeni. Opracowanie i adaptacja metody iPOND do materiału roślinnego rozszerzyły możliwości przyszłej analizy białek związanych z nowo syntetyzowanym DNA. Wyniki wskazują, że TO działa wielokierunkowo i może stanowić naturalny czynnik wspierający ochronę roślin przed stresem kadmowym.; In the context of increasing environmental cadmium (Cd) contamination, this study aimed to evaluate the effects of 24 h exposure to 175 μM CdCl₂ on root meristems of Vicia faba L. var. minor and to assess the protective effects of thyme essential oil (TO; 0.03%). Cd exposure caused substantial metal accumulation, reactive oxygen species (ROS) overproduction, increased lipid peroxidation, and DNA damage, despite activation of antioxidant mechanisms and thiol metabolism. These effects were accompanied by organelle ultrastructural alterations, MAPK activation, epigenetic reprogramming involving increased DNA methylation and altered histone modifications, and disturbances in replication and transcription. Reduced CDKA and CycB levels, abnormal histone H3 phosphorylation, and disorganization of microtubules and actin filaments contributed to inhibited meristematic cell proliferation and root growth. TO alone did not destabilize cellular structure or function, while in the presence of Cd it partially limited metal accumulation and alleviated its toxic effects. During simultaneous exposure to Cd and TO, reduced ROS accumulation, enhanced antioxidant responses, and lower lipid peroxidation and DNA damage were observed. TO also promoted preservation of cellular ultrastructure and attenuated Cd-induced disturbances in MAPK signaling and epigenetic regulation, maintaining transcription and replication closer to control levels. It additionally counteracted disorganization of the cytoskeleton and mitotic apparatus, thereby supporting meristematic cell proliferation and root growth. Adaptation of the iPOND method to plant material expanded opportunities for future analysis of proteins associated with newly synthesized DNA. Overall, TO exerted multifaceted protective effects and may support plant protection against cadmium stress. 2026-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/59161 Identyfikacja niskocząsteczkowych związków hamujących aktywność wybranych enzymów zaangażowanych w metabolizm RNA u Helicobacter pylori Skibiński, Jakub Mikołaj The increasing antibiotic resistance of Helicobacter pylori (H. pylori) significantly reduces the effectiveness of eradication therapies and highlights the urgent need to identify novel molecular targets for potential therapeutic substances. This study aimed to characterize selected components of the H. pylori RNA degradosome - polynucleotide phosphorylase (PNPase), the RNA helicase RhpA, and the protein PapS with particular emphasis on evaluating PNPase as a potential therapeutic target. Additionally, the function of PapS in RNA metabolism and its interaction with RhpA were investigated. Recombinant PNPase, RhpA, and PapS were successfully purified. Enzymatic assays for PNPase activity, including RNA polymerization and degradation reactions, were optimized to enable downstream inhibitor screening. The spatial structure of PNPase was resolved, followed by structural-functional analyses and interaction studies of the RhpA-PapS complex. PNPase was shown to form a homotrimeric assembly and to retain enzymatic activity under conditions compatible with high-throughput screening applications. PapS did not exhibit polyadenylation activity toward single-stranded RNA; however, it catalyzed the sequential addition of the 3′-terminal CCA sequence to tRNA, consistent with its role as a CCA-adding enzyme. A transient and moderate interaction between PapS and RhpA was detected. Transcriptomic analysis revealed limited changes in gene expression in the H. pylori G27 Δpnp and ΔpapS strains, whereas deletion of rhpA resulted in extensive transcriptomic remodeling. Although pnp deletion did not abolish bacterial viability, it markedly impaired adaptive capacity. The Δpnp strain displayed reduced tolerance to temperature stress (slower growth at 39°C and decreased survival at 4°C), increased sensitivity to UV-C radiation and oxidative stress, reduced motility and urease as well as catalase activity, while enhanced ability to biofilm complex formation, which needs further study to elucidate the potential mechanism. A four-stage screening strategy for PNPase inhibitors was implemented, integrating in vitro enzymatic assays, qualitative selection steps, and evaluation using bacterial cells. From a library of 8,562 compounds, 23 candidates were selected for further validation. Among them, niclosamide exhibited the most pronounced PNP-dependent activity profile. Collectively, these findings indicate that although H. pylori PNPase is not essential for viability, it represents a central regulatory node in RNA metabolism that governs stress response and adaptive phenotypes. Therefore, PNPase constitutes a rational and promising target for the development of novel antibacterial strategies.; Narastająca lekooporność Helicobacter pylori (H. pylori) na stosowane obecnie antybiotyki ogranicza skuteczność eradykacji, co wiąże się z koniecznością poszukiwania nowych celów molekularnych dla potencjalnych leków. W pracy scharakteryzowano wybrane komponenty degradosomu RNA H. pylori, biorąc pod uwagę ich strukturę i funkcję, a także wzajemne oddziaływania: fosforylazę polinukleotydową PNP (PNPazę), helikazę RhpA oraz białko PapS, ze szczególnym uwzględnieniem roli PNP jako potencjalnego celu terapeutycznego. Określono funkcję PapS w metabolizmie RNA i zbadano występowanie interakcji PapS-RhpA. Oczyszczono rekombinowane białka PNP, RhpA i PapS. Zoptymalizowano testy aktywności PNP (reakcje polimeryzacji i degradacji RNA). Wykazano, że PNPaza występuje w formie trimeru i zachowuje aktywność enzymatyczną w warunkach umożliwiających dalsze badania przesiewowe. PapS nie wykazywało aktywności poliadenylacyjnej wobec jednoniciowego RNA, natomiast katalizowało sekwencyjną dobudowę końca 3′ CCA do tRNA, co wskazuje na funkcję enzymu dobudowującego CCA. Stwierdzono przejściowe, umiarkowane oddziaływanie PapS-RhpA. Analiza transkryptomiczna ujawniła ograniczone zmiany ekspresji w szczepach delecyjnych H. pylori G27 Δpnp i ΔpapS oraz rozległą przebudowę profilu transkryptomicznego w ΔrhpA. Delecja pnp nie wiązała się z obumieraniem komórek, lecz powodowała istotne ograniczenie zdolności adaptacyjnych: obniżenie tolerancji na stres temperaturowy (wolniejszy wzrost w 39°C i słabsze przeżycie w 4°C), wzrost wrażliwości na UV-C i stres oksydacyjny, zahamowanie ruchliwości i aktywności ureazy oraz katalazy. Jakkolwiek delecja pnp wiązała się z nasileniem tworzenia obszaru biofilmu, czego wyjaśnienie wymaga dalszych badań. Zastosowano czteroetapową strategię przesiewową użytych w badaniach inhibitorów PNP łączącą testy in vitro, selekcję jakościową i ocenę działania wobec komórek bakteryjnych. Z biblioteki 8562 związków wyłoniono 23 kandydatów do dalszej weryfikacji, a najbardziej obiecujący profil działania zależny od obecności PNP wykazał niklozamid. Uzyskane wyniki wskazują, że PNPaza H. pylori, mimo że nie jest niezbędna do przeżycia bakterii stanowi kluczowy węzeł regulacji metabolizmu RNA determinujący odpowiedź stresową i fenotypy adaptacyjne bakterii oraz racjonalny cel dla poszukiwania inhibitorów PNP w celach terapeutycznych. 2026-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/58333 Szczepionka BCG jako immunomodulator wrodzonej odpowiedzi odpornościowej dzieci na antygeny wirusowych patogenów dróg oddechowych Jurczak, Magdalena Szczepionka BCG (Bacillus Calmette-Guérin), zawierająca atenuowany szczep Mycobacterium bovis, pozostaje jedyną dostępną szczepionką przeciwgruźliczą. Oprócz ochrony przed ciężkimi postaciami gruźlicy u dzieci wykazuje również nieswoiste działanie immunomodulacyjne związane z indukcją tzw. wytrenowanej odporności wrodzonej. Mechanizm ten opiera się na epigenetycznym przeprogramowaniu komórek odpornościowych, zwiększającym ich zdolność odpowiedzi na kolejne infekcje. Celem pracy była ocena nieswoistej odpowiedzi odpornościowej u dzieci w wieku 6–12 lat szczepionych BCG w okresie noworodkowym. Analizowano odpowiedź leukocytów pełnej krwi obwodowej stymulowanych in vitro prątkami BCG oraz antygenami RSV i SARS-CoV-2, oddzielnie lub łącznie. Oceniano produkcję cytokin pro- i przeciwzapalnych, odpowiedź interferonową, ekspresję receptorów monocytów (CD14, CD11b, HLA-DR, CD206) oraz receptora NOD2. Uwzględniono również status serologiczny dzieci wobec RSV i SARS-CoV-2. Wyniki wskazują, że szczepienie BCG może indukować długotrwałą wytrenowaną odporność wpływającą na odpowiedź wobec wirusów oddechowych. U dzieci seronegatywnych dominowała odpowiedź przeciwwirusowa związana ze wzrostem ekspresji IFN-β i IL-2, natomiast u seropozytywnych obserwowano jednoczesną aktywację odpowiedzi prozapalnej i regulatorowej. Wykazano także zwiększoną ekspresję NOD2 oraz receptorów monocytów po stymulacji BCG i antygenami wirusowymi. Uzyskane wyniki podkreślają potencjał BCG jako narzędzia immunomodulacyjnego wspierającego odporność przeciw różnym patogenom.; The BCG (Bacillus Calmette-Guérin) vaccine, containing an attenuated strain of Mycobacterium bovis, is the only available vaccine against tuberculosis. Besides protecting children against severe forms of tuberculosis, BCG also exerts non-specific immunomodulatory effects associated with the induction of trained innate immunity. This mechanism is based on the epigenetic reprogramming of innate immune cells, enhancing their ability to respond to subsequent infections, including unrelated pathogens. The aim of this doctoral dissertation was to evaluate the non-specific immune response in children aged 6–12 years vaccinated with BCG during the neonatal period. Peripheral blood leukocytes were stimulated in vitro with BCG bacilli and RSV or SARS-CoV-2 antigens, separately or in combination. The study assessed cytokine production, interferon responses, expression of monocyte surface receptors (CD14, CD11b, HLA-DR, CD206), and the NOD2 receptor, while also considering the serological status of the children. The results indicate that neonatal BCG vaccination may induce long-lasting trained innate immunity that shapes immune responses to respiratory viruses. In seronegative children, antiviral mechanisms characterized by increased IFN-β and IL-2 expression predominated, whereas seropositive children exhibited simultaneous activation of pro-inflammatory and regulatory responses. Increased NOD2 and monocyte receptor expression following stimulation with BCG and viral antigens further supports the persistence of trained immunity. The findings suggest that BCG enhances antiviral defense while modulating inflammatory responses, highlighting its potential as an immunomodulatory tool in the prevention of infectious diseases. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11089/58176 Zmiany strukturalne i funkcjonalne błon erytrocytów człowieka oraz białka modelowego albuminy narażonych na działanie nanocząstek polistyrenu o różnych średnicach (in vitro) Płuciennik, Kamil Plastics present in the environment undergo gradual degradation under the influence of physical and chemical factors into particles of increasingly smaller sizes, including microplastics with a diameter of < 5000 µm, and subsequently nanoparticles with a diameter of < 0.1 µm. These particles represent a significant source of exposure for living organisms. In recent years, an increasing amount of data has confirmed the presence of plastic particles in the human body, including in the blood, indicating the need to determine their potential impact on specific components of this tissue. Of particular importance is polystyrene, one of the most widely used plastics, whose particles have also been detected in human blood. The aim of this doctoral dissertation was to evaluate the effect of non-functionalized polystyrene nanoparticles (PS-NPs) of various diameters (~30 nm, ~45 nm, and ~70 nm) on the structure and function of the human erythrocyte membrane and albumin, the primary plasma protein. The results showed that PS-NPs, even at concentrations observed in the human body, interact directly with erythrocytes, leading to cell membrane stiffening and alterations in their rheological properties, while at a higher concentration of 100 µg/mL they also induce hemolysis. At the same time, the tested nanoparticles were not found to enhance the production of reactive oxygen species, induce oxidative stress, or activate erythroptosis, i.e., programmed erythrocyte death. Furthermore, the formation of a hard protein corona on the surface of the tested PS-NPs and changes in the secondary structure of human albumin were demonstrated. These observations suggest that polystyrene nanoparticles may affect the physiological functions of plasma albumin, and that modified albumin may indirectly exacerbate disturbances in the rheological properties of erythrocytes and potentiate the effects of PS-NPs under in vivo conditions.; Tworzywa sztuczne obecne w środowisku ulegają pod wpływem czynników fizycznych i chemicznych stopniowej degradacji do cząstek o coraz mniejszych rozmiarach, w tym mikroplastików o średnicy < 5000 µm, a następnie nanocząstek o średnicy < 0,1 µm. Cząstki te stanowią istotny czynnik narażenia organizmów żywych. W ostatnich latach coraz więcej danych potwierdza obecność cząstek plastiku w organizmie człowieka, również we krwi, co wskazuje na konieczność określenia ich potencjalnego wpływu na poszczególne składniki tej tkanki. Szczególne znaczenie ma polistyren, należący do najpowszechniej stosowanych tworzyw sztucznych, którego cząstki wykryto także we krwi człowieka. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej była ocena wpływu niefunkcjonalizowanych nanocząstek polistyrenu (PS-NPs) o różnych średnicach (~30 nm, ~45 nm i ~70 nm) na strukturę i funkcję błony erytrocytów człowieka oraz albuminy, będącej głównym białkiem osocza. Uzyskane wyniki wykazały, że PS-NPs już w zakresie stężeń obserwowanych w organizmie człowieka oddziałują bezpośrednio z erytrocytami, prowadząc do usztywnienia błony komórkowej oraz zaburzeń ich właściwości reologicznych, natomiast przy wyższym stężeniu 100 µg/mL wywołują także hemolizę. Jednocześnie nie stwierdzono, aby badane nanocząstki nasilały wytwarzanie reaktywnych form tlenu, indukowały stres oksydacyjny lub aktywowały eryptozę, czyli programowaną śmierć erytrocytów. Ponadto wykazano tworzenie się twardej korony białkowej na powierzchni badanych PS-NPs oraz zmiany w strukturze drugorzędowej albuminy ludzkiej. Obserwacje te sugerują, że nanocząstki polistyrenu mogą wpływać na fizjologiczne funkcje albuminy osocza, a zmodyfikowana albumina może pośrednio nasilać zaburzenia właściwości reologicznych erytrocytów oraz potęgować skutki działania PS-NPs w warunkach in vivo. 2025-01-01T00:00:00Z